Mikrobiológiai diagnosztika, a fertőzésekkel szembeni küzdelem alfája és ómegája
Barcs István dr.
Integráló Infekciókontroll, 2(3/4), 3-8, 2023.
Az orvosi mikrobiológia szorosan vett tárgya az embert megbetegíteni képes, vagy egészségét valamilyen módon érintő mikroorganizmusok vizsgálata. Ebből a szempontból elválaszthatatlan az állatorvosi mikrobiológiától (a zoonózisok, az embernek állati közvetítőkön keresztül fertőzést okozó speciesek miatt), valamint a környezeti (talaj-, víz-, levegő-, élelmiszer-) mikrobiológiától és mindentől, ami humán fertőzés forrása lehet, vagy a kórokozók időleges rezervoárjaként számításba jöhet. Gondoljunk az élelmiszer- és ivóvíz-fertőzésekre, a levegő útján terjedő fertőzésekre, az asztmát kiváltó gombaspórákra vagy akár a széklettel (is) ürülő kórokozók indikátorszerepére szennyvízből végzett kimutatásuk révén.
Hol van szerepe a mikrobiológiának?
A fertőzésekkel szembeni tevékenységek közül a leginkább magától értetődő a diagnosztika kiszolgálása. Az orvosi diagnosztika a betegség megállapításának tömör kifejezése. Ebben ugyanúgy szerepe van a képalkotó eljárásoknak, mint a laboratóriumi paraméterek vizsgálatának és a kórokozók közvetlen kimutatásának, vagy rájuk utaló közvetett bizonyítékok keresésének. A mikrobiológiai diagnosztikát nem lehet pótolni, kiváltani más diagnosztikai eljárásokkal (képalkotó vagy klinikai kémiai laboratóriumi leletekkel), sem a beteg fizikális vizsgálatával. Nem elegendő eljutni a gondolatig, hogy a beteg alighanem fertőzésben szenved; amíg nem ismerjük a fertőzés okozóját (eredetét, gyógyszer-érzékenységét, virulenciáját, egyedi jellemzőit), addig nincs esélyünk hatékony gyógyítására, a járványos terjedés megelőzésére, valamint epidemiológiai/népegészségügyi következtetések és prognózisok levonására [1, 2].
Klinikai mikrobiológia
A klinikai mikrobiológián a fertőző betegségek diagnosztizálásához nyújtott (mikrobiológiai) laboratóriumi hozzájárulást értjük. A klasszikus orvosdiagnosztikai laboratórium egyszerű kémiai és fizikai paraméterek mennyiségi, valamint a vér sejtes elemeinek mennyiségi és minőségi kimutatását, változásaikat és a normál tartománytól detektált eltérésüket vizsgálja, ma már jobbára automatizált módszerekkel. Az eltérések csak utalhatnak fertőzés vagy az azzal összefüggő gyulladás megjelenésére [3]. Fontosak a gyógyító orvos számára, és fontos hozzáadott értéket képviselnek a nozokomialitás kiszűrésében. De sem a szepszis diagnózisához, sem az antiinfektív kezelés indításához nem elegendőek, csak az első és leghamarabb megszülető elemek a diagnosztikus sorban.
A klinikai mikrobiológia egy zajló fertőzés igazolása, alátámasztása a feltételezett fertőzéshez társítható kórokozó vagy kórokozók kimutatásával. Több szóba jöhető infekcióforma közül a kimutatott kórokozók alapján a legvalószínűbb megerősítése, az etiológia, a lehetséges fertőző források/helyszínek összevetésével pontosítja a diagnózist. A vizsgálat a mintavételezéssel kezdődik. A mikrobiológiai minta a fertőzés gócából kontaminációtól mentesen nyert vizsgálati anyag, ami feldolgozásra alkalmas (életképes) formában tartalmazza az adott pillanatban ott jelen lévő mikroorganizmusokat, és a szállítás során sem a mennyiségük (csíraszámuk), sem kimutathatóságuk (életképességük) nem változik a feldolgozás megkezdéséig [4]. Ehhez a fertőzés jellegéhez, az anatómiai területhez, annak szokásos normál baktériumflórájának és a feltételezett kórokozó(k) fajtáinak megfelelő, valamint a feldolgozó laboratórium távolságához, elérhetőségéhez és együttműködési lehetőségéhez illeszkedő mintavételi eljárást és szállítási eszközt, módszert kell választani.
Természetesen mindez a mikrobiológia több, nem vagy nem közvetlenül orvosi vonatkozású ágában hasonló folyamatokat követ. A környezeti mintákat meghatározott mélységből vagy magasságból gyűjtik be szabványokban rögzített eljárásokkal és ugyanígy feldolgozásuk, értékelésük a klinikai mikrobiológiához nagyon hasonló eszközökkel, táptalajokon, milyen szemléletet követve zajlik. A cél az, hogy a kívánatos vagy az attól eltérő mikrobiológiai ökoszisztémát, annak összetételét felmérjék, az abban megjelent, az ökoszisztémára, vagy onnan a táplálékon, ivóvízen keresztül, de akár közvetlen kontaktussal az emberi szervezettel találkozva betegség kialakulásához vezethetnek. A minta, a vizsgálati anyag nemcsak emberi váladék, hanem víz-, talaj-, levegőminta, élelmiszer, kozmetikum, gyógyszer… A cél mindig a mikroorganizmusok (szükség szerint mennyiségi) kimutatása, közülük a vizsgálat irányából szignifikánsak meghatározása, jellemzése, más mintákból származó izolátumokkal történő összehasonlítása, és ha szükséges, elpusztításukra, mentesítésükre vonatkozó információk adása. Mindezt minél gyorsabban, de a pontosság feltétlen szem előtt tartásával, és olyan módszerekkel kell végezni, amelyek más laboratóriumokéival összevethető eredményt biztosítanak.
A mikrobiológiai diagnosztika
A mikrobiológiai diagnosztika lehet közvetlen és közvetett. A közvetlen kimutatás a mikroorganizmus megfigyelését jelenti a vizsgálati anyagban (pl. mikroszkóppal), illetve a minta makroszkópos megszemlélése, látható jellemzőinek leírása, amik jellemző kóros elváltozást mutatnak (véres, nyákos, megváltozott szín, szag, stb.).
A leggyakoribb, és más módszerrel ki nem váltható alapmódszer a tenyésztés. Ez a mikroorganizmus mesterséges megsokszorozását jelenti a valós életviszonyait optimálisan megközelítő mesterséges rendszerben (tápanyag-összetétel, hőmérséklet, atmoszféra, tenyésztési idő) azért, hogy mennyisége elérje az érzékelhető nagyságot, és további vizsgálatok (biokémiai tesztek, szerológia, antibiotikumérzékenység, virulenciapróbák, stb.) végzését tegye lehetővé. A baktériumok tápanyagigénye különböző, ezért többfajta táptalajt (tenyésztési módszert) kell párhuzamosan választani, és ezek attól függenek, milyen kórokozók megjelenésére kell számítani.
A közvetett kimutatás az adott mikroorganizmusra jellemző, abban mindig, másikakban viszont soha elő nem forduló molekulák (antigének, enzimek, DNS- vagy RNS-szakaszok), illetve az ellenükben termelődött specifikus antitestek (mennyiségi) kimutatását jelenti. Ha ezeket sikerül azonosítani, az azt jelenti, hogy az elmúlt időszakban a keresett mikroorganizmus is jelen (volt) a szervezetben.
A valós eredmény feltételei
Több feltételnek kell teljesülnie ahhoz, hogy a mikrobiológiai vizsgálat eredménye valós legyen, és ezek többsége nem a feldolgozó laboratóriumon múlik (Táblázat).
Táblázat. A jó mikrobiológiai eredmény feltételei [4]
| • Megfelelő mintavétel |
| – a fertőzött (a normálistól eltérő) helyre hatoló mintavétel |
| – kontaminációval szemben védett eljárás |
| • Késedelem nélküli feldolgozás |
| – haladéktalan továbbítás a feldolgozó laboratóriumba |
| • Megfelelő anyagfeldolgozás |
| – információk közlése a kórisméről |
- A vizsgálati anyagot onnan kell nyerni, ahol a zajló fertőzés góca feltételezhető, ahonnan a legnagyobb számban számíthatunk a kórokozó jelenlétére. Időpontját úgy kell megválasztani, hogy a mintában várhatóan a legnagyobb számban legyen jelen.
- A mintavételi eljárásnak biztosítania kell, hogy kontaminációmentesen érjük el a gócot, és onnan szintén kontaminációt elkerülve emeljük ki a mintát. Így az tartalmazni fogja a mintavétel helyén előforduló mikroorganizmusokat, és nem dúsul a közbeeső területeket benépesítő baktériumokkal.
- A mintavevő eszközt és a minta tárolására szolgáló edényt/közeget úgy kell megválasztani, hogy megőrizze a kórokozók életképességét és biztosítsa csíraszámuk állandóságát a feldolgozásig. A szokásos vattatampon felülete óriási, emiatt rajta a minta átlevegőzik, kiszárad, az oxigénre érzékeny baktériumok elpusztulnak. Az ideális transzportközegben tápanyagok nincsenek, a baktériumok osztódása nem indul meg, de az elektrolitos környezet pusztulásukat késlelteti.
- A mintát továbbításig olyan módon kell tárolni, hogy a feltételezett kórokozó ne szaporodjon, ne pusztuljon. Ehhez ismerni kell a zajló infekciót: a tárolás módját, hőmérsékletét a feltételezett kórokozó szerint kell megválasztani.
A mintavétel szabályairól, a valós eredmény megszületésének érdekében betartandó előírásokról a fertozesekrol.hu weboldal Szakmai információs anyagok rovata segít tájékozódni [5]. Az anyagfeldolgozás módjának megválasztásában nem a minta típusa (pl. vizelet) a döntő, hanem hogy milyen fertőzést feltételeznek (pl. vesemedence-gyulladás vagy húgyhólyaggyulladás), mivel ezek feldolgozása jelentősen különbözhet. Ezért a BNO kód, főleg a felvételi diagnózis BNO kódja semmi értékelhető támpontot nem nyújt ebben, teljesen félrevezető, irreleváns mikrobiológiai eredményekhez vezet.
Izolálható baktériumok
A bakteriológiai tenyésztés során az alkalmazott eljárás érzékenységének és specificitásának megfelelő mikroorganizmusok izolálhatók. A negatív tenyésztési eredmény oka vagy az, hogy a mintában nem volt mikroorganizmus, vagy az, hogy a vizsgálatkérő által adott információ szerint kiválasztott feldolgozási protokoll (táptalaj, aerob/anaerob légkör, tenyésztési idő) mellett azok nem mutattak érzékelhető növekedést.
A pozitív eredmény nem egyenértékű bármilyen mikroorganizmus detektálásával. Tudjuk, hogy az emberi testet baktériumokból és kisebb számban gombákból összetevődő normál flóra népesíti be, a külső és belső testfelületeken, illetve a bélcsatornában élő mikroorganizmusok száma tízszer-százszor haladja meg testi sejtjeink számát. Egy mikrobiológus nem tünteti fel a leleten az adott testtájon normál flórát alkotó baktériumokat, kivéve, ha azok aránya jelentősen eltolódott az egészséges összetételtől, de akkor is a „normál flóra mellett”, vagy „normál flóra helyett” megjegyzéssel. Klinikai szemléletű mikrobiológiai laboratóriumok általában nem közlik az adott esetben kontaminánsként vagy kolonizáló baktériumként minősíthető specieseket. Ezért kell minden fontos információt feltüntetni a vizsgálatkérő lapon, hogy a ritka és atípusos fertőzések kórokozói se vesszenek el, illetve a fertőzést adott mintatípusban csak ritka kórképek esetén kiváltó baktériumok is megfelelően legyenek értékelve (pl. Haemophilus parainfluenzae nem minősül felsőlégúti kórokozónak, kivéve az epiglottitiszt). Amennyiben a beteg állandó katétert vagy kanült visel, az ezzel összefüggésben megjelenő koaguláz-negatív staphylococcusokat vérből nem minősíthetik kontaminánsnak, azok a katéterezéssel összefüggő (véráram)fertőzések leggyakoribb kórokozói; katéter hiányában klinikai relevanciájuk valószínűsége kisebb. Ezért sem lehet a tenyésztések eredményére mechanikusan tekinteni, a „pozitív” eredmények óhatatlanul álpozitív eredményeket is tartalmaznak. Ez is indokolja a konzultáló mikrobiológia gyakorlatának széles körű meghonosítását (ami helyileg távoli mikrobiológiai centrumokra támaszkodva kivitelezhetetlen, és ezért nem is gazdaságos), valamint ismételten felhívja a figyelmet annak a megállapításnak az igazságára, hogy nem lehet térben, sem időben elválasztani a beteget és a diagnosztikát.
Molekuláris biológiai lehetőségek
A gyorsdiagnosztika célja, hogy mihamarabb, legkésőbb néhány órán belül választ adjon, jelen van-e a keresett, kiemelt veszélyességi kategóriába tartozó mikroorganizmus a vizsgálati anyagban. Ez csak molekuláris biológiai módszerekkel lehetséges: a célpont mikroorganizmus specifikus nukleinsav-szekvenciáinak vagy felszíni komponenseinek kimutatásával.
A baktérium- és ritkábban gombaizolátumok azonosításában is használjuk fajspecifikus antigénjeik kimutatását, vagy ha több fajra jellemző antigénjük van, akkor azok alapján csoportbesorolásuk is elvégezhető így. A koagglutinációs diagnosztikumok latex részecske felszínére rögzített specifikus antitesteket hordoznak, amik a baktérium felületi antigénjeivel immunkomplexet képeznek, és a mikroprecipitációt a latex részecskékkel közös kicsapódás teszi azonnal láthatóvá. Ugyanezen elv szerint végezhető így egyes baktériumok (pl. Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Haemphilus influenzae, stb.) azonosítása tenyészetből, vagy biológiai minta (pl. cerebrospinális folyadék) vizsgálatakor. Így jelentősen lerövidül a mikrobiológiai diagnosztika, a kiadott előzetes eredményre alapozva már célzott kezelés indítható.
Antigén-antitest reakción alapulnak a szerológiai vizsgálatok is. Az automatizált eljárás (pl. ELISA) során a beteg vérében a keresett kórokozó ellen termelődő antitestet, ritkábban magának a kórokozónak az antigénjét mutatjuk ki, ezzel igazoljuk a kórokozó jelenlétét, ami a zajló infekcióban betöltött szerepét támasztja alá, vagy a fertőzöttséget/hordozó állapotot jelzi. Ide sorolhatók azok a kromatográfiás tesztlapok is, amelyek legutóbb a COVID-19 járványban, vagy korábban influenzakimutatásban váltak ismertté, de betegágy melletti gyors szerológiai tesztként (Point-of-Care Testing, POCT), pl. HIV előzetes szűrésére is használatosak.
Egyes makromolekulák (pl. virulenciafaktorok, rezisztenciagének, ezekhez tartozó riboszómás RNS) kimutatása segít az izolátum kórokozó szerepének megerősítésében, valamint a legfontosabb antibiotikumok alkalmazhatóságának azelőtti jelzésében, hogy a hagyományos diagnosztika azt megerősítené [6]. Ugyanezek a módszerek a fajon belüli polimorfizmus vizsgálatára is alkalmasak, amivel egyaránt tisztázható több kórházi izolátum azonossága vagy különbözősége [7]. Így eldönthető, hogy ugyanabból a betegből többször kitenyésztett, de amúgy mindenhol jelen lévő gyakori baktérium (pl. E. coli, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, stb.) ismétlődő izolátumai egyezőek, ezáltal kórokozói szerepük megerősítve látszik, vagy különbözőségükből következően véletlenszerűen megjelenő, klinikailag irreleváns epizódok csupán. [8]
A diagnosztikában is, de még inkább a mikrobiológia összehasonlító alkalmazásában a molekuláris biológia egyre nagyobb szerepet játszik. Napjainkban a járványügyi laboratóriumok DNS- és RNS-alapú vizsgálatokkal követik a járványtörzsek terjedését, előre prognosztizálva a járványok jövőbeli alakulását, változását. A standard módszerek segítségével a különböző országok eredményei az egységes nemzetközi adatbázisba feltöltve azonnal megmutatják egy országban felbukkanó új klón rokonsági kapcsolatait és lehetséges eredetét [9].
A diagnosztika tárházában egyre nagyobb súllyal szerepel a MALDI-TOF, a mátrix által segített lézerdeszorpciós ionizáció (MALDI[1]), amit TOF[2] analizátorral kapcsolnak össze. Ennek leggyorsabb mintavételi gyakorisága 0,5 nsec. A MALDI-TOF MS módszer alkalmas nagy molekulatömegű anyagok, például fehérjék, szénhidrátok analízisére, ezáltal a legkülönfélébb baktériumfajok (diagnosztika) vagy fajon belüli csoportok gyors kimutatására, azonosítására (tipizálás), illetve az antimirkobás rezisztenciával kapcsolatban képződő proteinek detektálásával a hatékony célzott terápia és az antibiotikum stewardship fokozására.
A PCR technika szintén egyre tágabb alkalmazási lehetőségeket nyújt. A valósidejű PCR rendszerek klinikai mikrobiológiai felhasználásra kifejlesztett módszerei nem igényelnek speciális laboratóriumot, a minta amplifikációja ún. száraz csatlakozású tesztpatronban zajlik. Valamennyi prekurzort és reagenst a bemérés pillanatában hozzáadunk, további manipulációra nincs szükség. A teljes reakcióidő 50-90 perc, ezt követően az eredmény és a keletkezett DNS termékek mennyiségét jelző görbe megjeleníthető. A kimutatások baktériumfajok vagy azok jellegzetes tulajdonságainak (pl. antibiotikumrezisztencia) párhuzamos vizsgálatából állnak és sürgősségi betegfelvételt követően akár a műtéti előkészítés alatt eredményt adnak (pl. MRSA kimutatás).
Szintén DNS-kimutatáson nyugszik a DNS-chip módszere. A nozokomiális szempontból jelentős baktérium speciesek random ismétlődő DNS szekvenciáinak automatizált kimutatásával nagy felbontóképességű össszehasonlítást tesz lehetővé, az egy napon belül megszülető eredmények központi adatbázisba kerülnek, ahol más laboratóriumok, más országok eredményeivel összehasonlítva a klónok terjedésére is információt ad amellett, hogy adott kórházi halmozódásból azonnal kiválaszthatók az összetartozó izolátumok.
Mikrobiológia és a tűzoltók
Hankiss János szombathelyi belgyógyász Hajnali három / Habfürdő című könyvében a végeláthatatlan éjszakai ügyeletekben felötlő gondolatait adta közre. Ezek között olvasható a következő is:
„Amikor olyannyira büszkék vagyunk diagnosztikus teljesítményeinkre (ma ez az orvosi tevékenység magasra helyezett bálványa!), ne felejtsük el, hogy mindez nem több, mintha a tűzoltó megállna a lángoló épület előtt és megállapítaná, hogy az ég” [10].
Ő ezt a belgyógyászati diagnosztikára értette, természetesen. Továbbfűzve ezt a gondolatot és kiterjesztve a mikrobiológiai diagnosztikára azt mondhatjuk: A mikrobiológiai diagnosztika az, ami azt is megmutatja, mitől gyulladt ki az az épület, hogyan lehet eloltani és hogyan akadályozhatjuk meg, hogy futótűzzé válva más épületeket is elemésszen.
És ha mindezt gyorsan, de pontosságából nem veszítve teszi, az nem csak a tűzoltók, hanem valamennyiünk sikere.
Források
[1] Barcs I: Mikrobiológiával vagy anélkül. IME, 2013, 12(3), 26-29.
[2] Van-e szükség klinikai mikrobiológusokra? Lege Artis Medicinae, 2013, 23(7-8), 344-349..https://elitmed.hu/kiadvanyaink/lege-artis-medicinae/van-e-szukseg-klinikai-mikrobiologusokra/pdf-open
[3] Kormányos E: Laboratóriumi diagnosztika a fertőzések felismerésében. IME, 2018, 17(7), 43-47. https://www.imeonline.hu/article.php?article=2018._XVII./7/laboratoriumi_diagnosztika_a_fertozesek_felismereseben
[4] Barcs I: A mikrobiológiai mintavétel szabályai. A Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Kar Népegészségügyi Intézetének kiadványa. 2009. https://fertozesekrol.hu/konyvespolcra/szabadon-letoltheto/a-mikrobiologiai-mintavetel-szabalyai/
[5] Fertőzésekről.hu / Szakmai információs anyagok. https://fertozesekrol.hu/category/mentett-ertekek/szakmai-informacios-anyagok/
[6] Horváth A, Barcs I, Molnár J et al: Rendhagyó morfológiájú Escherichia coli gyors azonosítása szeptikus állapotú beteg hemokultúrájából fluoreszcens in situ hibridizációval. Infektol. Klin. Mikrobiol., 14: 117-120(2007)
[7] Barcs I, Horváth A, Pászti J et al: Molekuláris biológiai módszerekkel felderített húgyúti eredetű sepsis. Infektol Klin Mikrobiol, 15: 8-11 (2008)
[8]. Barcs I: Mikrobiológiai részvételre alapozott infekciókontroll. A Semmelweis Egyetem Egészségtudományi Kar Epidemiológiai Tanszékének kiadványa. 2012. https://fertozesekrol.hu/konyvespolcra/szabadon-letoltheto/mikrobiologiai-alapu-infekciokontroll/
[9] Becker A, Almási I, Székelyi K et al: Methicillinre rezisztens Staphylococcus aureus járvány felderítése a törzsek molekuláris biológiai jellemzésével. Infektol Klin Mikrobiol, 15: 164-170(2008)
[10] Hankiss J: Hajnali három / Habfürdő. Gondolat, Budapest, 1988. 94. old.
